上海秉越電子儀（yí）器有限公司

OOS(outofspecification,超限度、超規格)結果，是（shì）指產品質量（liàng）指標測（cè）試中超出已經（jīng）建（jiàn）立的可接受標準的單個（gè）或一（yī）係（xì）列結果（guǒ）。無菌產品的陽性結果、微生物限度試驗超出行動值或超過規格、內毒素試驗結果超標準（zhǔn）等均為OOS結果《中國藥典》2015年版m和（hé）新版《藥品生產質量管理規範》（GMP)增加了OOS調（diào）查章節，對微生（shēng）物實驗室00S結果的調查做出了較為詳細的闡述和實例分析，要求任何OOS結（jié）果必須按照書麵規（guī）程進行完整的調查。因為隻有確定了OOS結果產生的原因並判定其是否（fǒu）有效，進而（ér）才能製（zhì）訂完善（shàn）的預防和（hé）整改措施，以保證檢驗結果（guǒ）的準確性。因此，實驗室建立OOS調查處理程序，對OOS結果進行科學、及時（shí）、有效的調查分析處理是十分必要（yào）的微生物在自然環境中無處不在，並可能會隨檢驗人員、檢驗用器材以及檢（jiǎn）品的包裝（zhuāng）容器進入檢驗環境。因此（cǐ），關於（yú）微生物檢驗中藥品的無菌檢査項目，新版藥典對其操作環境提（tí）出（chū）了更（gèng）高要求（qiú），新版GMP也加強了對無菌操作環（huán）境空氣微生物、表麵微生物以及人員手套和操作服表（biǎo）麵微生物的監測頻率，並（bìng）做出了明確規定。而對（duì）於無菌檢査OOS結果（guǒ）的（de）調（diào）査，需核實的相關記錄和影響因素更為繁雜。基於它的複雜性，OOS結果的調（diào）查須追溯到實驗過程的每一個環節，而對於（yú）它的變異（yì）性，調（diào）查過程又需針對不同（tóng）的OOS結果著重分析調（diào）查相應的不同（tóng）環節。
對於微生物實驗室OOS的（de）調查，局限於每個檢驗單位的（de）技術水（shuǐ）平和資源，同樣（yàng）限於人類對微（wēi）生物掌握的局限，不（bú）是每次的OOS調査都可以發現其根本原因，但通過此調査過程仍能夠幫助調查者找出超標結果發生的可能原因並進而采取糾正預防措（cuò）施，基於風險分析，對相關批（pī）次產品做出最（zuì）後處理決定'從而降低藥品質量風險，既是保證（zhèng）藥品質量的重要工作，又是質（zhì）量體係持續改進的原動力。本文通過對4批無菌產品的無菌檢査實驗（yàn）全過程的回顧性分析和調查，探索導致無菌實驗（yàn）OOS結果的（de）明確原因，以期建立微生物（wù）實驗室完善的OOS調査方案。
1、材料、儀（yí）器與試劑
全自動智能無（wú）菌集菌儀（yí）(上海秉越zw-2008)一（yī）次性使用全封閉集菌培養（yǎng）器（qì）顯（xiǎn）微鏡AxiosescopeA
全自（zì）動微生物鑒定儀
酵母菌鑒定（dìng）卡
無菌檢查樣品為4個批號的注射用頭孢噻膀鈉。
2、方法（fǎ）與結果
2.1實驗方法
 
2.1.1藥（yào）品的無菌檢查
依照《中國藥典》2010年版_檢（jiǎn）驗注射用頭孢（bāo）噻肟（wò）鈉的無（wú）菌檢查項目。
2.1.2鏡檢及鑒定
取陽性樣本，劃線TSA平板培養24~48h，按照儀器及試劑的使用說明，對經過純化的微生物進（jìn）行革蘭氏染色，確定微生（shēng）物形態，然後（hòu）根據形態選擇鑒定卡（kǎ），使用全自動微生物鑒定（dìng）儀Vitek2Compact進行鑒定。
 
2.2結果
 
4個批號的注射用頭孢噻肟鈉的無菌檢（jiǎn）查檢驗結果如表1所示：2號和4號樣品改良馬丁培養基（jī）均在第3天變渾濁。取改良（liáng）馬丁培養液劃線TSA平板，30~35℃培養48h，平板（bǎn）上呈現白色、光滑、邊緣整齊、形態單一的菌落。
革蘭氏染（rǎn）色鏡檢結果為酵母菌。經全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact鑒定，均為季也蒙假絲酵母。
 
3、OOS結果的調查和（hé）分析
依據新版GMP對OOS調查的（de）要求（qiú），回（huí）顧性分析調（diào）查注射用頭孢噻肟鈉（nà）無菌檢查（chá）OOS結果產（chǎn）生的原因。
 
①日常監（jiān）控和驗收記錄：
培（péi）養基的驗收記錄（lù）、培養基（jī）的製備和滅菌記錄、檢驗器（qì）具準備和滅菌記錄、消毒液配置和無菌過濾（lǜ）記錄、潔（jié）淨室清潔消毒記錄、檢（jiǎn）驗員使用潔淨服的滅（miè）菌記錄和（hé）使用記錄（lù）、無菌檢驗操作記錄以及環境監（jiān）控記錄等均未發現異常。
②人員：
甲和乙實驗人員均（jun1）能熟練掌握無菌（jun1）檢驗的流程、監控要點和無菌操作規範。
③樣品：
確認樣品的編號和批號無誤，無菌檢査取樣前，樣品西林瓶（píng）外觀正常，西林瓶蓋並未發（fā）現鬆動的跡象。
④實驗器具：
實驗中使用的py330集菌器、一次件使用無菌注射器以及一（yī）次性使用無菌手套的無菌驗收（shōu）均符合規定，且用於當天其（qí）他檢品的檢（jiǎn）驗，並未發現汙（wū）染情（qíng）況（kuàng）。
⑤培（péi）養基（jī）及衝洗液和稀釋液：
無菌檢查用培養基（jī）的陰性對照均符合規定，且同批（pī）製備和滅菌的培養基用於同日檢查的其他檢品，並未發現（xiàn）汙染情況（kuàng）。
⑥檢驗環境：
現場環境監控的3皿沉（chén）降菌監測（cè）的TSA平（píng）皿均未有菌落生長，並（bìng）未出現汙（wū）染情況（kuàng）。定期環境（jìng）檢測表麵菌符合規定，樣品無菌檢查當日潔淨（jìng）空調係統均運行正常。
⑦不（bú）同檢驗體係對結果判（pàn）定造成的影響：
由於現行《中國藥典》無菌檢查使（shǐ）用的改良馬丁培養基不同於國際標準（zhǔn）使用的TSB,將改良馬丁培養物劃線TSA平板上長出的菌落接種至TSB培養液中in),24h後培養液即出現混濁現象（xiàng）。因此可以排除因檢驗體係不同造成的實驗結果偏差。
⑧菌株：
樣品檢（jiǎn）出菌經鑒定為（wéi）季也蒙假絲酵母菌，比對曰常（cháng）潔（jié）淨室監控收集的菌（jun1）株建立的菌庫，潔淨室中（zhōng）從未監測到（dào）此（cǐ）種菌株。
⑨附加實驗的結（jié）果（guǒ）與分析：
通過以上分析，初步認定（dìng）無菌不合（hé）格為實驗有效（xiào）結果。但鑒於（yú）此次無菌檢驗過程並未嚴格按照新版GMP和《中（zhōng）國藥典（diǎn）》2015年版規（guī）定的對（duì）檢驗環境和人員的全麵監（jiān）控，環境和人員帶來的汙染仍有造成（chéng）OOS結果的可能性（xìng），附加實驗就是對檢驗環境進行全麵監（jiān）測。
現場（chǎng）環境監控按照新版GMP的要求實施，並增加對潔淨室回風（fēng）口浮遊菌的監測，監測結果均符合規定。微生物監（jiān）測方麵，除（chú）實驗人員無（wú）菌服胸口處采集（jí）到一個菌落，其他均未有菌落生長。實驗（yàn）人員無菌服（fú）采集到的菌落為革蘭氏陽性球菌，經鑒定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌（jun1）），此（cǐ）菌（jun1）種曾在日常（cháng）潔淨室監控中不止（zhǐ）一次檢（jiǎn）出（chū）過，並未對樣品產生過（guò）汙染（rǎn）。
4、結論與討論
OOS結果表明，並未在實驗室發現導致OOS結果的明確原因，檢出菌也並非由於實驗室檢驗過程帶（dài）來的汙染，懷疑樣品本身（shēn）被（bèi）季也蒙假（jiǎ）絲酵母菌所汙染（rǎn），從而導致無菌檢查的陽性結果。
通過對上述OOS的調（diào）查和分析，初（chū）步建（jiàn）立了微生物實驗室OOS結果調（diào）查的分（fèn）析方案，分別從人、機、料、法、環5個方麵進行闡述：
人——實驗人員。考（kǎo）察人員（yuán）是否經過相關檢驗的培訓和考核，是否了解該項檢驗的流程和監控要（yào）點。無菌（jun1）區全體人員每年應進行一次再培訓和資格的再確認，對無菌區人員操作服和手套表麵的微生物監測嚴格（gé）按新版GMP執行；
機（jī）——實驗中使用的儀器（qì）設備。檢查集菌儀等儀器近期使用記錄是否發（fā）現異常，參數設置是否（fǒu）正確。儀器的計（jì）量和校準均需在有效期內（nèi），無（wú）菌區內使用（yòng）的儀（yí）器需（xū）定期消毒並定期進行微生物的表麵（miàn）監測，使用的器具需經滅菌消毒（dú），一次性（xìng）使用器（qì）具需經（jīng）質（zhì）量驗收；
料（liào）——樣品、培養基、稀釋液和衝洗液。檢查剩餘樣品的編（biān）號和批號（hào）是否準確，樣品的外觀是否異常，瓶蓋是否（fǒu）有鬆脫現象以（yǐ）及樣品的前（qián）期存放（fàng）條件（jiàn）和取樣方式是否合理。必要時，對樣品的瓶（píng）蓋和瓶口等關鍵部位擦（cā）抹取樣，培養觀察；
檢查培養基質量驗收記錄和配製記錄，確認配製和滅菌是否合理（lǐ）有效，是否用於其他樣品的檢驗，培養基、稀釋（shì）液（yè）和（hé）衝洗液的陰性對照應符（fú）合規定；
法——檢驗方法和依據。實驗所用標準應符合設定實驗和檢驗（yàn）依據的要求；
環——實驗環境。檢查潔淨空調係統是否運行正常，監測記錄包括定期監控記錄和實驗現場環境監控記錄，是否符合潔淨（jìng）度要求，清潔記錄顯示是否按時清（qīng）潔，消毒液是否使用合（hé）理。另（lìng）外，未確定OOS結果產生的明確原因時，不能急於對環境進行消毒處理，以免忽略了可能的環境汙染因素。
 
微生物負荷和實（shí）驗檢（jiǎn）出菌的比對（duì）分析。實驗室的微生物負荷，包括潔淨室的空氣微生物、表（biǎo）麵（miàn）微生（shēng）物和人員（yuán）操作服及手套的（de）表麵微生物。對日常環境監控收集的菌株進行有效鑒別和分析，建立潔（jié）淨室生物負載數據庫，可為微生（shēng）物OOS調査提供數據基礎。
 
對檢出菌進行鑒定，分析監控收集的微生（shēng）物分布和鑒定與陽性結（jié）果（guǒ）的（de）相關性，當發現（xiàn）與陽性菌株相近的菌株時，可利用分子（zǐ）生物學方法比對陽性（xìng）菌株與微生物負（fù）荷的同源性，為陽性菌的汙染溯源提供依（yī）據。
此外，對（duì）不同實驗會產生不同的OOS結果，可針對某些相關環節靈活考察。例如，針對不同的微生物，采用不同的監（jiān）測手段，陽性檢（jiǎn）出菌為酵母菌時，增加（jiā）沙氏葡萄糖瓊脂（zhī）用（yòng）於環境監控（kòng）的附加實驗（yàn），則能夠更好地確認（rèn）環境中的該類微生物。
需要著重強調的是（shì），檢出菌的鑒別對於OOS結果的調查非常關鍵，決定最後是否可以發現根本原因，應該給予足夠重視。
綜上所述，微生物相關檢驗項目OOS結果的調查工作（zuò）量很大，且專業性強，實驗室不僅需要具備受過良好培訓和具有豐富檢驗經驗（yàn）的工作人員，還需建立完善的OOS調查方案來規範調查（chá）操作。